Identificazione dei consumatori di glicani nei campioni di microbiota intestinale umano utilizzando l’etichettatura metabolica abbinata alla fluorescenza

Nature Communications volume 14, numero articolo: 662 (2023) Citare questo articolo

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La composizione e il metabolismo del microbiota intestinale umano sono fortemente influenzati dai glicani complessi della dieta, che causano effetti a valle sulla fisiologia e sulla salute degli ospiti. Nonostante i recenti progressi nella nostra comprensione del metabolismo dei glicani da parte dei batteri intestinali umani, abbiamo ancora bisogno di metodi per collegare i glicani ai batteri che li consumano. Qui utilizziamo un test funzionale per identificare e isolare i batteri intestinali da volontari umani sani che assorbono diversi glicani. Il metodo combina l'etichettatura metabolica utilizzando oligosaccaridi fluorescenti con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), seguito dal sequenziamento degli ampliconi o dalla culturomica. I nostri risultati dimostrano l'etichettatura metabolica in vari taxa, come Prevotella copri, Collinsella aerofaciens e Blautia wexlerae. La validazione in vitro conferma la capacità della maggior parte, ma non di tutte, le specie etichettate di consumare il glicano di interesse per la crescita. Parallelamente, mostriamo che i consumatori di glicani che abbracciano tre phyla principali possono essere isolati da colture di cellule etichettate selezionate. Collegando i batteri ai glicani che consumano, questo approccio aumenta la nostra comprensione di base del metabolismo dei glicani da parte dei batteri intestinali. In futuro, potrebbe essere utilizzato per fornire informazioni sul meccanismo degli approcci prebiotici, in cui i glicani vengono utilizzati per manipolare la composizione del microbiota intestinale.

Il microbiota intestinale è parte integrante della fisiologia umana, poiché metabolizza la nostra dieta, sintetizza vitamine e aminoacidi essenziali, allena il sistema immunitario e ci protegge dagli agenti patogeni1,2,3,4,5. I progressi negli strumenti genetici e bioinformatici hanno portato a una nuova comprensione della complessità e della diversità del microbiota intestinale, nonché della sua importanza nelle malattie umane6. Il microbioma intestinale è arricchito di geni coinvolti nella glicolisi e nel metabolismo dei carboidrati2,7. Attraverso questi enzimi carboidrati-attivi (CAZymes), i batteri intestinali metabolizzano glicani complessi derivati dalla dieta (fibre alimentari) che raggiungono il colon non digeriti dall'ospite8,9. Di conseguenza, la dieta è un fattore determinante della composizione e della diversità del microbiota intestinale, più dei fattori genetici10. Infatti, i cambiamenti nella dieta tipicamente determinano rapide modificazioni metaboliche microbiche e un’alterata struttura della comunità microbica7,11. È importante sottolineare che anche sottili differenze strutturali nei glicani possono produrre risultati metabolici microbici distinti negli studi di integrazione umana12.

La nostra comprensione di CAZymes sta avanzando rapidamente, come esemplificato dalla caratterizzazione dei loci di utilizzo dei polisaccaridi (PUL) in Bacteroidetes, come il sistema di utilizzo dell'amido (SUS) ampiamente studiato in Bacteroides thetaiotaomicron13. Il locus Sus codifica per le proteine responsabili del legame (SusDEF) e della degradazione della superficie cellulare (SusG) dei polisaccaridi dell'amido in oligosaccaridi che vengono trasportati nel periplasma dal trasportatore TonB-dipendente SusC, dove vengono ulteriormente trasformati in monosaccaridi dalle glicosidi idrolasi ( GH) SusAB14. Allo stesso modo, sono stati descritti PUL specifici per molti altri glicani, come mannano, β-glucano, xiloglucano e galattomannano15,16,17,18,19. D'altra parte, i batteri Gram-positivi contengono trasportatori che possono internalizzare strutture oligosaccaridiche come i fruttooligosaccaridi (FOS) mediante il MsmEFGK a quattro componenti in Lactobacillus acidophilus20, o β-mannani mediante una proteina legante il soluto (MnBP) e due permeasi (MPP) in Roseburia intestinalis21. Nonostante questi progressi, molti PUL hanno ancora specificità di substrato sconosciute e le famiglie GH possono avere più substrati, rendendo difficile prevedere l’attività in base al sequenziamento9,13,22,23,24. Pertanto, sono necessari metodi funzionali che colleghino i glicani ai loro consumatori primari, soprattutto per i Firmicutes e altri membri meno studiati del microbiota intestinale umano25.

99% identity and coverage). Note that all annotations are considered putative and subject to improvement as database errors are resolved and new species are characterized./p>99% identity, and 100% identity was obtained for 86 out of the 93 ESVs. The sorted glycan+ samples exhibited lower bacterial α-diversity indices (observed ESVs, Chao1, and Shannon) than those of the starting stool samples, which is consistent with the labeled cells representing a subset of the initial gut microbiota samples (Fig. S3a). A principal component analysis (PCoA) showed a clustering of samples according to the individual (Fig. S3b), indicating that interpersonal differences in microbial communities explained most of the variance (45%). However, constrained ordination (CAP) analysis was performed using the labeled cells versus the initial stool samples as an a priori hypothesis and produced two distinct clusters on an ordination axis; this result explained 9% of the variance (Fig. S3c) and once again supported the enrichment of specific bacterial taxa from the original stool sample. Clustering of NYST-F+ cells from the other two probes was observed by further constraining the analysis by glycan type (Fig. S3d)./p>99% identity and coverage thresholds. α- and β-diversity and ordination were analyzed using R scripts with the vegan library, and differential abundance analysis was performed using DESeq249./p>