Le DARPine legano i loro bersagli citosolici dopo essere state traslocate attraverso il poro protettivo dell'antigene della tossina dell'antrace

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 8048 (2023) Citare questo articolo

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Le interazioni intracellulari proteina-proteina nelle vie di segnalazione aberranti sono emerse come bersaglio primario in diverse malattie, in particolare nel cancro. Poiché molte interazioni proteina-proteina sono mediate da superfici piuttosto piatte, in genere non possono essere interrotte da piccole molecole poiché richiedono cavità per legarsi. Pertanto, si potrebbero sviluppare farmaci proteici per competere con interazioni indesiderate. Tuttavia, le proteine ​​in generale non sono in grado di traslocare da sole dal lato extracellulare al sito bersaglio citosolico, e quindi un efficiente sistema di traslocazione proteica, che combini idealmente una traslocazione efficiente con la specificità del recettore, è molto richiesto. La tossina dell'antrace, l'olotossina tripartita del Bacillus anthracis, è una delle tossine proteiche batteriche meglio studiate e ha dimostrato di essere un candidato adatto per la traslocazione cellula-specifica di carichi in vitro e in vivo. Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato una variante dell'antigene protettivo (PA) mirato fusa con diverse proteine ​​Ankyrin Repeat (DARPin) progettate per ottenere la specificità del recettore e abbiamo incorporato un dominio del recettore per stabilizzare il preporo e prevenire la lisi cellulare. È stato dimostrato che questa strategia fornisce elevate quantità di DARPin cargo fuse dietro i 254 amminoacidi N-terminali del fattore letale (LFN). Qui, abbiamo stabilito un test di legame citosolico, dimostrando la capacità delle DARPin di ripiegarsi nel citosol e legare il loro bersaglio dopo essere stato traslocato dal PA.

Le interazioni intracellulari proteina-proteina nelle vie di segnalazione aberranti sono emerse come bersaglio primario in diverse malattie, in particolare nel cancro1,2,3. Il rilascio diretto specifico delle cellule di molecole inibitorie altamente specifiche fornirebbe un modo efficiente e selettivo per prendere di mira solo i percorsi aberranti all'interno di una cellula in un tessuto desiderato. La maggior parte delle terapie oggi si basa sulla funzione inibitoria di piccole molecole permeabili alle cellule4,5. Queste, tuttavia, non possono essere rese cellule-specifiche e molte superfici di interazione proteina-proteina sono grandi, piuttosto piatte e idrofobiche, prive di una tasca di legame per piccole molecole e quindi lasciano molte superfici di interazione proteina-proteina non trattabili6,7.

I progressi nella generazione di molecole leganti basate su scaffold di legame alternativi, come le DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins), hanno consentito la generazione efficiente di piccole proteine ​​leganti praticamente contro qualsiasi bersaglio8. Le DARPine, a differenza degli anticorpi, non richiedono disolfuri per la stabilità e hanno dimostrato di ripiegarsi bene quando espresse nel citoplasma di molte cellule8,9,10. Poiché le proteine, tuttavia, non sono in grado di traslocare da sole dal lato extracellulare al sito bersaglio citosolico, è molto richiesto un efficiente sistema di traslocazione proteica, che combini idealmente una traslocazione efficiente con la specificità del recettore. Le tossine proteiche batteriche si sono evolute naturalmente per traslocare la loro proteina carica tossica nel citosol in modo cellula-specifico6,11. Il nostro gruppo e altri hanno adattato tali tossine per fornire carichi non nativi alle cellule che esprimono vari recettori11,12,13,14,15,16,17.

La tossina dell'antrace, l'olotossina tripartita del Bacillus anthracis, è una delle tossine proteiche batteriche meglio studiate e ha dimostrato di essere un candidato adatto per la traslocazione cellula-specifica di carichi alternativi alla propria componente tossica in vitro e in vivo12,18,19, 20. Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato una variante dell'antigene protettivo (PA) con retargeting che è fusa con un legame DARPin con retargeting al recettore di scelta, qui EpCAM legato dal DARPin Ac2, per ottenere la specificità del recettore e incorporando un dominio del recettore per stabilizzare il preporo e prevenire la lisi cellulare. Utilizzando il dominio di traslocazione della tossina dell'antrace, questo sistema ha dimostrato di essere in grado di trasportare elevate quantità di carichi19,21. Poiché le DARPin possono essere facilmente selezionate per legarsi praticamente a qualsiasi bersaglio e poiché hanno dimostrato di essere efficaci all'interno del citosol, sono state utilizzate da noi e da altri come molecole cargo alternative fondendo la DARPin dietro i 254 amminoacidi N-terminali. di LF (LFN). Poiché LFN e DARPin sono collegati in modo flessibile, è ragionevole supporre che DARPin mantenga le sue caratteristiche vincolanti in questo contesto8,19,22. I due componenti del sistema di trasporto sono rappresentati in Fig. 1.